Probiótico Bifidobacterium lactis V9 Regula a Secreção de Hormônios Sexuais em Pacientes com Síndrome do Ovário Policístico através do Eixo Intestino-Cérebro

ABSTRATO
Embora poucos estudos tenham investigado a microbiota intestinal de mulheres com síndrome dos ovários policísticos (SOP), os mecanismos funcionais e metabólicos dos micróbios associados à SOP, bem como potenciais biomarcadores microbianos, ainda não foram identificados. Para resolver essa lacuna, projetamos um experimento de duas fases no qual realizamos o sequenciamento metagenômico de shotgun e monitoramos os parâmetros metabólicos, mediadores do intestino-cérebro e hormônios sexuais de pacientes com SOP. Na primeira etapa, identificamos um desequilíbrio na microbiota intestinal dos pacientes com SOP, observando que Faecalibacterium , Bifidobacterium e Blautia foram significativamente mais abundantes no grupo controle, enquanto Parabacteroides e Clostridiumforam enriquecidos no grupo SOP. Na segunda etapa, monitoramos o impacto do probiótico Bifidobacterium lactis V9 no microbioma intestinal, mediadores intestino-cérebro e hormônios sexuais de 14 pacientes com SOP. Notavelmente, observamos que os níveis de hormônio luteinizante (LH) e LH/hormônio folículo-estimulante (LH/FSH) diminuíram significativamente em 9 voluntários, enquanto os níveis de hormônios sexuais e ácidos graxos intestinais de cadeia curta (AGCCs) aumentaram acentuadamente. Em contraste, as mudanças nos índices mencionados acima foram indistintas nos 5 voluntários restantes. Os resultados de uma análise do número de células viáveis ​​de Bifidobacterium lactis V9 nos dois grupos foram altamente consistentes com os resultados clínicos e SCFA. Portanto, a colonização intestinal efetiva do probióticoBifidobacterium lactis V9 foi crucial para sua capacidade de funcionar como um probiótico. Finalmente, propomos um mecanismo potencial descrevendo como os probióticos regulam os níveis de hormônios sexuais manipulando o microbioma intestinal em pacientes com SOP.
IMPORTÂNCIA A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é ​​um distúrbio metabólico comum entre mulheres em idade reprodutiva em todo o mundo. Por meio de um experimento clínico de duas fases, primeiro revelamos um desequilíbrio no microbioma intestinal de pacientes com SOP. Ao classificar e anotar sequências metagenômicas shotgun em espécies metagenômicas (MGS), 61 MGSs foram identificados como potenciais biomarcadores microbianos relacionados à SOP. Na segunda etapa, monitoramos o impacto do probiótico Bifidobacterium lactis V9 na microbiota intestinal, parâmetros metabólicos, mediadores intestino-cérebro e hormônios sexuais de pacientes com SOP. Notavelmente, observamos que os índices clínicos relacionados à SOP e as microbiotas intestinais dos pacientes participantes exibiram uma resposta inconsistente à ingestão de B. lactisV9 probiótico. Portanto, a colonização eficaz do probiótico no intestino do hospedeiro foi crucial para sua capacidade de funcionar como probiótico. Finalmente, propomos um mecanismo potencial pelo qual B. lactis V9 regula os níveis de hormônios sexuais manipulando o microbioma intestinal em pacientes com SOP.

INTRODUÇÃO
O microbioma intestinal humano é essencial para a manutenção do sistema imunológico e da saúde humana ( 1 ). Nas últimas décadas, estudos em escala populacional destacaram o papel potencial do microbioma intestinal na alteração do estado de saúde do hospedeiro. Evidências emergentes indicam que existe uma estreita relação entre a microbiota intestinal e várias doenças metabólicas crônicas, incluindo diabetes tipo 2 ( 2 ), cirrose hepática ( 3 ), gota ( 4 ), câncer colorretal ( 5 ), artrite ( 6 ) e até mesmo distúrbios cerebrais como a doença de Alzheimer ( 7 , 8 ) e a doença de Parkinson ( 9). Consequentemente, alterações severas na estrutura microbiana intestinal e numerosos biomarcadores microbianos específicos para essas doenças crônicas foram gradualmente descobertos. Além disso, estratégias de tratamento direcionadas aos microbiomas intestinais dos pacientes foram consideradas e representam uma nova abordagem no diagnóstico e tratamento de doenças.
A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é ​​um distúrbio endócrino-metabólico comum em mulheres em idade reprodutiva, com prevalência mundial de 4% a 21%, dependendo dos critérios diagnósticos utilizados ( 10 ). A SOP é uma doença metabólica típica correlacionada com múltiplos fatores de risco físicos, incluindo obesidade, hipertensão, dislipidemia e resistência à insulina ( 11 ). A maioria dos estudos sobre SOP se concentrou em parâmetros metabólicos e níveis de hormônios sexuais, embora alguns estudos tenham se concentrado na relação entre SOP e a microbiota intestinal usando análises de sequenciamento de rRNA 16S ( 12 – 14). No entanto, estudos usando tecnologias multiômicas, incluindo sequenciamento metagenômico profundo, são urgentemente necessários para explorar os mecanismos microbianos funcionais e metabólicos subjacentes à SOP e identificar potenciais biomarcadores específicos de cepas para esta doença.
A eficácia dos probióticos na regulação e reconstrução do microbioma intestinal do hospedeiro é bem reconhecida, e a estratégia de interferência probiótica tem sido usada para prevenir e curar várias doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo 2 ( 15 ), doença inflamatória intestinal (DII)/síndrome do intestino irritável (SII) ( 16 ) e hiperglicemia ( 17 ). Recentemente, foram relatados os efeitos benéficos da suplementação de probióticos em marcadores do metabolismo da insulina e alguns perfis lipídicos em mulheres com SOP ( 18 ). Consequentemente, levantamos a hipótese de que o uso de probióticos poderia aliviar os sintomas da SOP em pacientes através da regulação do microbioma intestinal.
Para resolver esses problemas, projetamos um experimento de coorte que incluiu duas fases. Na primeira etapa, a estrutura taxonômica da microbiota intestinal nos participantes foi determinada por meio de sequenciamento de alto rendimento dos genes 16S rRNA bacterianos. Além disso, a investigação dos perfis funcionais dos microbiomas correspondentes e a identificação dos micróbios significativamente diferentes foram realizadas por sequenciamento metagenômico de espingarda profunda. Além disso, índices clínicos relacionados à doença e metabólitos microbianos foram correlacionados com os biomarcadores específicos. Na segunda etapa, monitoramos o impacto da suplementação de probióticos no microbioma intestinal de pacientes com SOP pelo uso de Bifidobacterium lactisV9, que foi previamente isolado do trato gastrointestinal (GI) de uma criança saudável da Mongólia, pois essa cepa exibiu excelentes características probióticas em nosso estudo anterior. Os resultados deste estudo fornecem novos insights sobre a patogênese e tratamento da SOP e oferecem dados objetivos e detalhados que apoiam o uso de tratamentos probióticos para doenças metabólicas.
RESULTADOS
Análise comparativa dos índices clínicos medidos nos grupos controle e SOP.
No presente estudo, os índices clínicos foram medidos em pacientes com SOP e indivíduos saudáveis ​​( Tabela 1 ; ver também Tabela S1 e Fig. S1no material complementar). Os valores médios determinados para parâmetros metabólicos, incluindo níveis de triglicerídeos (TGs), colesterol total (CT) e glicemia de jejum (FPG), no grupo SOP foram 1,64 ± 0,26 mmol/litro, 4,73 ± 0,29 mmol/litro, e 5,98 ± 0,57 mmol/litro, respectivamente, e foram significativamente maiores do que no grupo controle. Além disso, os níveis metabólicos do peptídeo típico mediadores do intestino-cérebro YY (PYY) e grelina atingiram 85,16 ± 10,11 pg/ml e 0,54 ± 0,03 ng/ml, respectivamente, no grupo controle e foram significativamente maiores do que aqueles no grupo SOP . Além disso, determinamos os níveis de hormônios sexuais, incluindo hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH), prolactina (PRL), estradiol (E2) e testosterona (T), no dia 3 do ciclo menstrual para cada assunto de estudo.

TABELA 1TABELA 1 A análise comparativa dos índices clínicos representando os grupos controle e SOP a

ParâmetroValoresValor P
ajustado
Controle
( n = 26)SOP
( n = 38)Antropométrico
    Idade (anos ± SD) 26,69 ± 1,95 27,61 ± 3,82 0,329
    HAIR-AN (nº de pacientes/nº total de pacientes) 0/26 38/09 N / D
    Acne (nº de pacientes/nº total de pacientes) 26/04 38/12 N / D

Metabólico (mmol/litro ± SD)
    TG 1,2 ± 0,21 1,65 ± 0,26 0,017
    TC 4,07 ± 0,26 4,73 ± 0,3 0,021
    FPG 5,53 ± 0,31 5,98 ± 0,57 0,001

Mediadores cérebro-intestino (± SD)
    Grelina (ng/ml) 0,54 ± 0,03 0,25 ± 0,03 <0,001
    PYY (pg/ml) 53,46 ± 16,25 85,16 ± 10,11 <0,001

Hormônios sexuais (± SD)
    LH (UI/litro) 7,22 ± 2,45 17,96 ± 3,84 <0,001
    FSH (UI/litro) 4,71 ± 0,57 6,98 ± 1,42 0,053
    LH/FSH 1,57 ± 0,61 2,63 ± 0,61 <0,001
    E2 (pg/ml) 52,82 ± 6,08 56,32 ± 15,02 0,166
    PRL (ng/ml) 9,22 ± 1,37 11,79 ± 1,61 <0,001
    T (nm/litro) 0,83 ± 0,3 6,02 ± 1,13 <0,001

SCFA (μmol/g ± SD)
    Ácido acético 57,36 ± 9,33 24,6 ± 8,94 0,008
    Ácido propiónico 20,14 ± 5,96 13,93 ± 3,84 <0,001
    ácido butírico 12,86 ± 4,2 5,05 ± 1,59 0,021
    Ácido valérico 1,66 ± 0,64 0,55 ± 0,3 0,003

uma
HAIR-AN, hiperandrogenismo (HA), resistência à insulina (IR) e acantose nigricans (AN); NA, não aplicável.MATERIAL SUPLEMENTAR
FIG S1
Análise comparativa dos índices clínicos dos grupos controle e SOP. Cada ponto de cor (verde para o grupo controle e rosa para o grupo SOP) representa os valores médios dos parâmetros metabólicos, incluindo triglicerídeos (TGs), colesterol total (CT), glicemia de jejum (FPG), hormônio sexual, ácidos graxos (SCFAs) e os mediadores típicos do cérebro e intestino PYY e grelina. Baixe FIG S1, arquivo TIF, 0,2 MB .
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TABELA S1
Os índices clínicos e corporais para todos os voluntários. Baixe a Tabela S1, arquivo XLSX, 0,02 MB .
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Desequilíbrios na microbiota intestinal de pacientes com SOP.
Para cada um dos 64 indivíduos, a estrutura do organismo da microbiota intestinal foi analisada pelo sequenciamento dos amplicons do gene 16S rRNA. Uma análise de coordenadas principais (PCoA) foi realizada com base nas distâncias UniFrac ponderadas e não ponderadas dos perfis de sequência de rRNA 16S ao nível do género ( Fig. 1A e B ). As microbiotas intestinais dos grupos controle e SOP foram altamente distintas em relação à estrutura do organismo, com os indivíduos formando dois agrupamentos que corresponderam aos dois grupos experimentais. Para corrigir qualquer possível estratificação populacional causada por fatores não relacionados à doença que possam afetar a estrutura da microbiota intestinal, foi realizado um teste de Adonis ( Tabela S2 e S3). Após a correção, os efeitos associados aos fatores não relacionados à doença desapareceram. Por exemplo, os valores de R 2 que representavam a correlação entre os valores que representam certos fatores do hospedeiro (ou seja, idade e HAIR-AN [hiperandrogenismo {HA}, resistência à insulina {IR} e acantose nigricans {AN}] e valores de acne) e a microbiota intestinal do hospedeiro foram 0,023, 0,023 e 0,011, respectivamente. Esses valores são muito inferiores aos valores de R 2 determinados para o fator de doença, confirmando ainda que a SOP foi um fator significativo explicando a variação observada na microbiota intestinal. Em nível de gênero, observamos que a abundância de Faecalibacterium , Lachnospira ,Bifidobacterium e Blautia foram significativamente maiores no grupo controle do que no grupo SOP, enquanto os de Parabacteroides , Bacteroides , Lactobacillus , Oscillibacter , Escherichia/Shigella e Clostridium foram enriquecidos no grupo SOP ( Fig. 1C ; testes de soma de classificação de Wilcoxon) .

FIGURA 1FIG 1 As alterações na microbiota intestinal dos pacientes com SOP. (A e B) Gráfico de pontuação da análise de componentes principais (PCoA) com base em métricas UniFrac ponderadas (A) e não ponderadas (B) para todos os participantes. Cada ponto de cor (verde para o grupo controle e rosa para o grupo SOP) representa a composição da microbiota intestinal com base nos resultados do sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA realizado para cada sujeito. (C) As diferenças em micróbios intestinais entre os grupos SOP e controle no nível de gênero. A significância foi calculada pelo teste de soma de postos de Wilcoxon.MATERIAL SUPLEMENTAR
TABELA S2
Variáveis ​​baseadas em distância UniFrac ponderadas e não ponderadas (testes Adonis). Baixe a Tabela S2, arquivo DOCX, 0,03 MB .
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TABELA S3
Espécies metagenômicas baseadas em distância UniFrac ponderadas e não ponderadas (testes de Adonis). Baixe a Tabela S3, arquivo DOCX, 0,04 MB .
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Para explorar ainda mais os micróbios intestinais diferenciais no nível da cepa, agrupamos os dados de sequenciamento metagenômico shotgun em 1.080 grupos de genes de coabundância (CAGs) ( Tabela S4 ), e os 151 CAGs contendo mais de 50 contigs foram reagrupados em MGS. Finalmente, 45 MGS receberam níveis taxonômicos específicos. Através de uma análise comparativa, observamos que 30 CAGs, incluindo Subdoligranulum variabile MGS031, Prevotella copri MGS035, Eubacterium rectale MGS044, Eubacterium eligens MGS013, Dialister invisus MGS048, Collinsella aerofaciens MGS060, Bacteroides vulgatus MGS014, Bacteroides uniformisMGS022, Bacteroides sp. MGS027, Bacteroides caccae MGS018 e Alistipes putredinis MGS041 foram enriquecidos no grupo SOP ( Fig. 2B ), enquanto 31 CAGs, incluindo Bifidobacterium sp. MGS003, Faecalibacterium prausnitzii MGS004, Bacteroides sp. MGS008, Bifidobacterium animalis MGS015, Roseburia inulinivorans MGS148, Coprococcus eutactus MGS007, Bifidobacterium pseudocatenulatum MGS052, Roseburia intestinalis MGS026, Bacteroides stercoris MGS016, Coprococcus vem MGS023,Bacteroides plebeius MGS006 e Faecalibacterium prausnitzii MGS032 foram enriquecidos no grupo controle ( Fig. 2A ). Curiosamente, notamos a falta dos micróbios benéficos Faecalibacterium prausnitzii e Bifidobacterium sp., bem como a presença dos micróbios relacionados à doença Prevotella copri e Collinsella aerofaciens , nos pacientes com SOP.

FIGURA 2FIG 2 Caracterização taxonômica da microbiota intestinal (espécies metagenômicas [MGS]) nos diferentes grupos. Redes MGS diferencialmente abundantes que foram enriquecidas no grupo controle ( n  = 31; painel A, verde) e nos indivíduos SOP ( n  = 30; painel B, rosa). A rede foi construída com base nos valores do coeficiente de correlação de postos de Spearman determinados em comparações de diferentes MGS. A largura da borda é proporcional à força da correlação. O tamanho do nó é proporcional à abundância média na respectiva população. Cada nó representa um MGS, e o MGS identificado é anotado com sua espécie conforme indicado na nota de rodapé.MATERIAL SUPLEMENTAR
TABELA S4
O perfil de espécies metagenômicas (MGS) para todos os sujeitos. Baixe a Tabela S4, arquivo XLSX, 0,09 MB .
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Alterações nas vias metabólicas microbianas anotadas e ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs).
Para investigar as diferenças observadas nos perfis funcionais da microbiota intestinal entre os pacientes com SOP e os indivíduos saudáveis, leituras de alta qualidade de todas as amostras foram obtidas e anotadas para genes codificadores de proteínas. Com base nos resultados, foi criado um catálogo coletivo e não redundante de genes da microbiota intestinal para SOP. Em seguida, para cada amostra, as leituras foram mapeadas para o catálogo coletivo de genes para reconstruir os perfis de genes específicos da amostra, e os perfis também foram gerados usando os ortólogos do banco de dados da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KO; Tabela S5). Vias metabólicas associadas ao metabolismo da frutose e da manose, ciclo do citrato (ciclo do ácido tricarboxílico [TCA]), montagem flagelar, quimiotaxia bacteriana, resistência ao peptídeo antimicrobiano catiônico (CAMP), biossíntese de lipopolissacarídeos, sistema fosfotransferase (PTS), metabolismo da biotina, biossíntese do folato , metabolismo de tiamina e um pool de carbono por folato foram enriquecidos no grupo SOP, enquanto as vias metabólicas associadas à biossíntese de valina, leucina e isoleucina, metabolismo de propanoato, biossíntese de ácidos graxos, transportadores ABC e sistemas de secreção bacteriana foram enriquecidas no grupo controle ( Fig. 3 ). Assim, determinamos as concentrações de ácidos graxos de cadeia curta, incluindo ácidos acético, propiônico, butírico e valérico ( Tabela 1 ; veja tambémFig. S1 ), que são considerados os principais metabólitos benéficos microbianos intestinais, nas amostras fecais dos participantes. Sem surpresa, as quantidades de ácidos acético, propiônico, butírico e valérico em pacientes com SOP foram 24,59 ± 8,94, 13,93 ± 3,84, 5,05 ± 1,59 e 0,55 ± 0,29 μmol/g, respectivamente, e foram significativamente menores do que no grupo controle .

FIG 3FIG 3 As pontuações Z do repórter transformadas em log das vias metabólicas mostrando diferenças significativas entre os grupos SOP e controle. Os nós verdes representam as vias metabólicas (no nível 3) enriquecidas no grupo controle (CO), e os nodos rosa representam as vias metabólicas (no nível 3) enriquecidas no grupo SOP (SOP). O tamanho do nó representa a pontuação alterada. As vias metabólicas no nível 2 são exibidas em cores diferentes. CoA, coenzima A.MATERIAL SUPLEMENTAR
FIG S2
A estrutura da microbiota intestinal mudou marcadamente no grupo de resposta (grupo R, n  = 9) com base na distância UniFrac ponderada de sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA. Os pontos exibindo diferentes formas e diferentes profundidades de cor verde (a cor verde escureceu gradualmente durante o período de 0 a 10 semanas) representam a composição da microbiota intestinal de cada sujeito. Baixe FIG S2, arquivo TIF, 0,4 MB .
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TABELA S5
O perfil KEGG para todos os assuntos. Baixe a Tabela S5, arquivo XLSX, 2,3 MB .
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Análise de correlação do MGS identificado e os parâmetros metabólicos, SCFAs e hormônios sexuais.
Explorámos ainda as correlações entre os MGS identificados, parâmetros metabólicos, SCFAs e hormonas sexuais construindo uma rede baseada nos coeficientes de correlação de classificação de Spearman determinados ( Fig. 4 ; ver também Tabela S6 ). Conforme mostrado na Fig. 4 , uma correlação geralmente positiva foi observada entre Bifidobacterium animalis e Faecalibacterium prausnitzii e os SCFAs, bem como os mediadores do cérebro-intestino, enquanto uma correlação negativa foi observada entre essas duas espécies e os níveis de hormônios sexuais. Em contraste, as espécies Coprococcus eutactus , Collinsella aerofaciens , Prevotella copri e Bacteroides caccaeforam positivamente correlacionados com os níveis de hormônios sexuais, mas negativamente correlacionados com os níveis de SCFAs e mediadores intestino-cérebro. Ao realizar o teste Adonis nos dados da matriz de distância UniFrac mostrados na Fig. 1 usando as mesmas variáveis ​​listadas na Fig. 4 , ligamos as interpretações dos dados de sequenciamento do amplicon 16S e os dados de sequenciamento metagenômico ( Tabela S2 e S3 ). As variáveis ​​(incluindo TGs, TC, LH, T, PYY, grelina e SCFAs) e as espécies metagenômicas (incluindo Bifidobacterium animalis MGS015, Bifidobacterium sp. MGS003 e Bifidobacteriumsp. MGS009) foram intimamente correlacionados com alterações na microbiota intestinal dos pacientes com SOP.

FIG 4FIG 4 A rede de correlação construída usando as espécies metagenômicas identificadas (MGS), parâmetros metabólicos (incluindo TGs, TC e FPG), SCFAs (incluindo ácido acético, propiônico, butírico e valérico), mediadores intestino-cérebro (PYY e grelina) , e hormônios sexuais (incluindo LH, FSH, LH/FSH, E2, PRL e T) com base no coeficiente de correlação de classificação de Spearman ( R maior que 0,4 ou R menor que -0,4). A largura e a cor da borda (vermelho, positivo; verde, negativo) são proporcionais à força da correlação. O tamanho do nó é proporcional à abundância média na respectiva população. Nós com a mesma cor são classificados como o mesmo tipo de indicadores. Bif, Bifidobacterium .MATERIAL SUPLEMENTAR
TABELA S6
Os valores de R representam comparações entre as espécies metagenômicas (MGS) e os fatores clínicos. Baixe a Tabela S6, arquivo XLSX, 0,03 MB .
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Flutuações nos níveis de SCFAs, hormônios sexuais e peptídeos de sinal relacionados à colonização de Bifidobacterium lactis V9.
Depois de demonstrar as alterações no microbioma intestinal no grupo SOP nos níveis taxonômico e funcional, investigamos ainda os principais papéis dos micróbios benéficos Bifidobacterium e Faecalibacterium prausnitzii , que estavam intimamente correlacionados com SOP. Considerando sua segurança e universalidade e os resultados de nossos estudos anteriores ( 19 , 20 ), escolhemos a cepa probiótica Bifidobacterium lactis V9 para os experimentos subsequentes. Quatorze pacientes com SOP participaram de um estudo para investigar o impacto do Bifidobacterium lactisV9 na microbiota intestinal de indivíduos com SOP. Ao monitorar os níveis de hormônio sexual, peptídeo sinal e SCFA intestinal nos 14 voluntários durante o período de consumo de Bifidobacterium lactis V9, observamos mudanças dramáticas nos índices mencionados acima. Os níveis de LH e LH/FSH diminuíram significativamente em 9 voluntários, enquanto os níveis de hormônios sexuais aumentaram acentuadamente, assim como os níveis de SCFA intestinais, incluindo os níveis de ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico e ácido valérico ( Fig. 5 ). Em contraste, as flutuações nesses índices não foram notáveis ​​nos 5 voluntários restantes. Assim, os 14 voluntários foram divididos em dois grupos, a saber, o grupo de resposta (grupo R) e o grupo de não resposta (grupo N).

FIG 5FIG 5 Alterações dinâmicas nos níveis de hormônios sexuais (painel A para LH e painel B para LH/FSH), mediadores do intestino cerebral (painel C para grelina e painel D para PYY) e SCFAs (painéis E, F, G, e H para ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico e ácido valérico, respectivamente) durante a Bifidobacterium lactisEstágio de consumo V9. Cada painel é composto por dois grupos: o grupo de resposta (grupo R; as mudanças nos índices listados acima foram notáveis ​​para este grupo) e o grupo sem resposta (grupo N; as mudanças nos índices listados acima foram limitadas para este grupo). Os dados de significância foram calculados usando o teste de Kruskal-Wallis (para comparações de dados de vários pontos de tempo) e o teste de soma de postos de Wilcoxon (para comparações de dados de dois pontos de tempo [emparelhados]). As tendências de variação nos índices listados acima para cada participante são indicadas com uma linha contínua.
Os probióticos são definidos como microrganismos vivos que conferem benefícios à saúde da microbiota intestinal do hospedeiro quando presentes em quantidades adequadas. O trato gastrointestinal do hospedeiro é o principal “campo de batalha” onde o probiótico é capaz de exercer suas funções de promoção da saúde. Portanto, a colonização efetiva de um probiótico consumido no intestino do hospedeiro é crucial para suas características de promoção da saúde. Ao realizar PCR quantitativa (q-PCR) com um primer específico para a cepa, quantificamos o número de células viáveis ​​de Bifidobacterium lactis V9 nos dois grupos. Os resultados foram altamente consistentes com os resultados clínicos e SCFA. Observamos que a abundância média de Bifidobacterium lactis V9 viável atingiu 6,93 ± 0,42 log UFC/g de fezes no grupo R durante oFase de consumo de Bifidobacterium lactis V9 ( Fig. 6 ). Mais convincentemente, nenhum declínio significativo na abundância de células viáveis ​​foi observado durante a fase de eliminação no grupo R. Em contraste, poucos organismos probióticos vivos Bifidobacterium lactis V9 sobreviveram nos intestinos dos participantes do grupo R nas fases de consumo e eliminação. Esses resultados indicam uma correlação robusta entre a abundância do probiótico colonizado Bifidobacterium lactis V9 e os índices clínicos relacionados à SOP e AGCCs intestinais.

FIG 6FIG 6 Quantificação de Bifidobacterium lactis V9 vivo em amostras fecais durante os estágios de ingestão e washout para o grupo de resposta (grupo R, n  = 9) e o grupo sem resposta (grupo N, n  = 5). Os diferentes estágios experimentais, incluindo os estágios de linha de base (ponto A), consumo de probióticos (pontos B, D e F) e washout (pontos C, E e G), estão dispostos na parte inferior, superior e central. do diagrama de Sankey. As espessuras das curvas em diferentes cores representam as quantidades médias de Bifidobacterium lactis V9 viáveis ​​em amostras fecais. Conforme mostrado na figura, as linhas no painel A são grossas, o que indica que a quantidade média de Bifidobacterium lactis viávelV9 no grupo R foi alto, enquanto as linhas no painel B são finas, o que indica que a quantidade média de Bifidobacterium lactis V9 viável no grupo N foi baixa.
Diferentes respostas da microbiota intestinal ao consumo do probiótico Bifidobacterium lactis V9.
Com base nos resultados descritos acima, abordamos ainda a questão de como a microbiota intestinal respondeu à ingestão do probiótico Bifidobacterium lactis V9 no grupo R e no grupo N. Sem surpresa, mudanças marcantes na estrutura da microbiota intestinal foram observadas no grupo R através de uma análise de coordenadas principais (PCoA) com base na distância UniFrac ( Fig. 7A ; ver também Fig. S2 ). Nesse grupo, foram observadas abundâncias aumentadas dos gêneros Bifidobacterium , Faecalibacterium , Butyricimonas e Akkermansia , além de diminuição nas abundâncias dos gêneros Collinsella , Coprococcus ,Klebsiella , Clostridium , Actinomyces , Streptococcus , Eubacterium e Ochrobactrum ( Fig. 7C ; ver também Tabela S7 ). Em contraste, a influência do probiótico Bifidobacterium lactis V9 nas microbiotas intestinais no grupo N foi limitada ( Fig. 7B ), e fatores individuais dominaram a estrutura das microbiotas intestinais ao longo do experimento.

FIG 7FIG 7 A microbiota intestinal apresentou uma resposta inconsistente à ingestão do probiótico Bifidobacterium lactis V9. (A) A estrutura da microbiota intestinal mudou marcadamente no grupo de resposta (grupo R, n  = 9) com base na distância UniFrac ponderada de sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA. Os pontos exibindo diferentes profundidades de cor verde (a cor verde escureceu gradualmente de 0 a 10 semanas) representam a composição da microbiota intestinal dos indivíduos. (B) A influência do probiótico Bifidobacterium lactis V9 na microbiota intestinal no grupo sem resposta (grupo N, n = 5) foi limitado de acordo com os clusters com base na distância ponderada do UniFrac. Os pontos com a mesma cor representam a composição da microbiota intestinal do mesmo participante em diferentes momentos. (C) Um mapa de calor representando as mudanças microbianas intestinais no nível de gênero no grupo R em diferentes estágios de consumo de Bifidobacterium lactis V9. Os graus de profundidade da cor representam as abundâncias relativas do gênero relacionado. O valor de P foi calculado para cada gênero pelo teste de Kruskal-Wallis, e os dados estão anotados no lado esquerdo. Valores de P inferiores a 0,05 estão marcados em vermelho.MATERIAL SUPLEMENTAR
TABELA S7
A abundância em nível de gênero determinada para cada voluntário no estágio 2. Faça o download da Tabela S7, arquivo XLSX, 0,03 MB .
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DISCUSSÃO
A síndrome dos ovários policísticos leva a várias complicações, incluindo hiperandrogenismo, obesidade e síndrome metabólica. Neste estudo, de acordo com a literatura atual, foi demonstrado que os níveis de LH, testosterona e PRL estavam elevados e que os níveis de mediadores cérebro-intestino, incluindo grelina e PYY, foram reduzidos em pacientes com SOP em comparação com os níveis em saudáveis controles. A grelina é um peptídeo acilado de 28 aminoácidos que foi identificado no estômago de ratos, e sua presença aumenta o apetite, reduz a utilização de gordura e leva à adiposidade ( 21 ). PYY é colocado com GLP-1 nas células L do intestino distal e está envolvido no chamado “freio ileal” ( 22 ).). Observações recentes revelaram que, além desses conhecidos efeitos metabólicos, a grelina e o PYY também estão envolvidos em outras funções relacionadas ao eixo hipotálamo-hipófise-gônada ( 23 ). Em consonância com nossos resultados atuais, pesquisadores anteriores relataram que os fatores responsáveis ​​pelos níveis elevados de LH e testosterona nos grupos SOP foram a grelina e o PYY ( 24 ), o que destacou a importância da grelina e do PYY na patogênese de certos parâmetros da SOP.
Vários estudos recentes demonstraram uma ligação entre a microbiota intestinal e a SOP. Esses estudos envolveram mulheres da Europa e China diagnosticadas com SOP ( 25 , 26 ). A SOP foi associada a uma mudança na composição geral das bactérias no intestino, incluindo uma diminuição na diversidade alfa, bem como a mudanças na diversidade beta. No presente estudo, também observamos um desequilíbrio na microbiota intestinal em pacientes com SOP. Estudos anteriores confirmaram que os níveis de hormônios sexuais estão ligados a mudanças no microbioma intestinal, e muitas mulheres com SOP têm hiperandrogenismo, que está associado à desregulação metabólica ( 13 ).). Assim, o desequilíbrio microbiano no intestino pode ser atribuído à SOP, e a conclusão foi verificada pela análise estatística subsequente dos resultados do teste Adonis. Além de detectar mudanças na composição geral do microbioma intestinal, revelamos mudanças nas abundâncias relativas de espécies específicas em mulheres com SOP ao realizar a análise MGS. Curiosamente, notamos a falta dos micróbios benéficos Faecalibacterium prausnitzii e Bifidobacterium sp. em pacientes com SOP, bem como a presença dos micróbios relacionados à doença Prevotella copri e Collinsella aerofaciens . Bifidobactériadesempenha um papel importante na manutenção da saúde humana, estimulando a imunidade natural e contribuindo para o equilíbrio da microbiota ( 27 ). Foi relatado que Faecalibacterium prausnitzii possui propriedades anti-inflamatórias e contribui para a saúde intestinal através da produção de butirato. Micróbios intestinais como Faecalibacterium prausnitzii e Bifidobacterium sp. são muitas vezes referidas como “boas bactérias” porque exibem propriedades promotoras da saúde ( 28). Propõe-se que um aumento nos níveis dessas bactérias no intestino leva à produção de SCFAs que melhoram a saúde intestinal, aumentando a função de barreira do intestino e reduzindo a translocação de endotoxinas bacterianas através da parede intestinal, onde podem produzir inflamação e resistência à insulina ( 29 ). Assim, a depleção significativa de Faecalibacterium prausnitzii e Bifidobacterium é uma característica típica do distúrbio da microbiota intestinal, e também explica o declínio na biossíntese de SCFA em pacientes com SOP.
No experimento subsequente, os índices clínicos relacionados à SOP e a microbiota intestinal dos 14 pacientes participantes (grupo R e grupo N) apresentaram uma resposta inconsistente à ingestão do probiótico Bifidobacterium lactis V9. Em combinação com os resultados da análise de viabilidade celular de Bifidobacterium lactis V9, deduzimos que a colonização efetiva do probiótico Bifidobacterium lactis V9 no trato GI do hospedeiro é crucial para suas características probióticas. Além disso, entender os princípios subjacentes à colonização bacteriana de longo prazo em humanos é crucial para o sucesso das terapias baseadas em microbiomas ( 28 , 30 ).). Especulamos quais fatores influenciaram a colonização efetiva do probiótico Bifidobacterium lactis V9 no GI do hospedeiro. Um estudo anterior in vivo relatou que sob condições de administração oral a voluntários, o probiótico Bifidobacterium longum AH1206 persistiu no intestino de mais de 30% dos indivíduos ( 27 ). Esses autores determinaram que a colonização da cepa estava relacionada à baixa abundância do residente B. longume a sub-representação de genes específicos de utilização de carboidratos no intestino. Assim, eles concluíram que as limitações filogenéticas e a disponibilidade de recursos são dois fatores potenciais que controlam a colonização de nicho de micróbios introduzidos. No presente estudo, observamos resultados semelhantes. A abundância relativa do gênero Bifidobacterium nos membros do grupo R ( n  = 9) na linha de base foi de 0,62, que foi ligeiramente inferior à abundância relativa nos membros do grupo N (0,81, n = 5), mas a diferença não foi estatisticamente significativa. No início do experimento, um total de 31 pacientes com SOP assinaram o termo de consentimento informado e concordaram em participar da etapa de consumo de probióticos sem consumir outras drogas. No entanto, devido a seus fatores físicos e psicológicos, 17 pacientes começaram a consumir uma droga relacionada à SOP durante o experimento. Portanto, tivemos que excluir as amostras dos 17 voluntários do restante do estudo, e apenas 14 pacientes terminaram todo o experimento conforme planejado. Assim, a coorte em pequena escala limitou a significância estatística dos dados de quantificação ( 31 ). No entanto, considerando que o probiótico Bifidobacterium lactis V9 utilizado na presente pesquisa pertence ao gênero Bifidobacterium, também destacamos o mecanismo de exclusão competitiva dos mesmos micróbios filogenéticos que controlam a colonização de nicho de micróbios introduzidos ( 28 ).
Levando em conta as observações do impacto de Bifidobacterium lactis V9 na microbiota intestinal e a correlação entre a microbiota intestinal e índices clínicos relacionados à SOP e níveis de SCFA, propomos um mecanismo potencial ( Fig. 8 ) pelo qual o probiótico Bifidobacterium lactis V9 regula os níveis de hormônios sexuais através do microbioma intestinal em pacientes com SOP. O mecanismo regulador pode ser descrito como se segue. O consumo do probiótico Bifidobacterium lactis V9 promove o crescimento de micróbios produtores de SCFA, como Faecalibacterium prausnitzii , Butyricimonas e Akkermansia . Esses micróbios, assim comoBifidobacterium , produzem níveis aumentados de SCFAs, impactando a secreção de mediadores intestino-cérebro, incluindo grelina e PYY. Finalmente, mudanças nos níveis de PYY e grelina levam a flutuações nos níveis de hormônios sexuais secretados pela hipófise e hipotálamo através do eixo intestino-cérebro. Nesse contexto, o probiótico Bifidobacterium lactis V9 pode promover a exclusão competitiva de outras bactérias não produtoras de AGCC pelas ações inibitórias diretas ou pela atividade competitiva exercida pela cepa probiótica ou pela influência da cepa probiótica na microbiota comensal endógena . – 34 ). Em consonância com nosso presente estudo, ao fornecer probióticos contendo Lactobacillus , Bifidobacteriume selênio, Jamilian et al. demonstraram que a coadministração de probióticos e selênio em mulheres com SOP resultou na diminuição dos escores de Ferriman-Gallwey modificados e na diminuição dos níveis totais de testosterona e melhora significativa dos parâmetros de saúde mental ( 35 ). Eles concluíram que os mecanismos potenciais pelos quais os probióticos podem melhorar a secreção hormonal estavam relacionados à reconstrução do microbioma intestinal, ao aprimoramento da digestão e absorção de nutrientes dietéticos ( 36 ) e à interação com o eixo intestino-cérebro ( 37 )). A comunicação dos micróbios intestinais para o sistema nervoso central ocorre principalmente por meio de reguladores microbianos, com os melhores exemplos incluindo SCFAs e metabólitos de triptofano. Embora alguns desses intermediários interajam diretamente com células enteroendócrinas, células enterocromafins e o sistema imunológico da mucosa, resultando na propagação da sinalização “bottom-up”, outros intermediários são capazes de atravessar a barreira intestinal para entrar na circulação sistêmica e podem até mesmo atravessar a barreira hematoencefálica ( 38 ). Acetato, propionato e butirato são os principais ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) produzidos pelas bactérias intestinais a partir de vários substratos, incluindo fibras não digeríveis ( 39 ), e esses AGCCs exercem efeitos multiorgânicos no metabolismo energético do hospedeiro ( 29 )., 40 ). Receptores para SCFAs estão presentes em células enteroendócrinas, e propionato pode ativar diretamente a liberação de PYY e GLP-1 de células L in vitro e in vivo em humanos ( 38 , 41 , 42 ). Finalmente, a correlação negativa observada entre os níveis dos mediadores do eixo intestino-cérebro, incluindo PYY e grelina, e os de LH, um hormônio sexual típico relacionado à SOP, foi amplamente relatada ( 12 , 31 , 43 , 44 ). Em resumo, a microbiota intestinal e os AGCCs metabólicos podem desempenhar um papel fundamental na regulação dos hormônios sexuais e intestinais em indivíduos com SOP.

FIG 8FIG 8 O mecanismo potencial pelo qual o probiótico Bifidobacterium lactis V9 regula os níveis de hormônios sexuais através do microbioma intestinal em pacientes com SOP.
Os resultados do presente estudo revelaram alterações nos microbiomas intestinais de pacientes com SOP e identificaram vários biomarcadores microbianos relacionados à SOP. Além disso, descobrimos um mecanismo potencial pelo qual o probiótico Bifidobacterium lactis V9 modula os níveis de hormônios sexuais em indivíduos com SOP através do eixo intestino-cérebro. Os resultados deste estudo fornecem novos insights sobre a patogênese e tratamento da SOP e oferecem dados objetivos e detalhados que apoiam o uso de tratamentos probióticos para doenças metabólicas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Desenho experimental e recrutamento de sujeitos.
A coorte experimental foi composta por 64 sujeitos que foram divididos em dois grupos.
O primeiro grupo (grupo caso) consistiu em 38 pacientes com SOP (com idades entre 22 e 38 anos) que foram recrutados no Hospital Geral de Hainan, localizado em Haikou, província de Hainan, na China. O diagnóstico de SOP foi confirmado por ultrassonografia B e diagnóstico de oligomenorreia grave e pela avaliação dos níveis de hormônios gonadais dos indivíduos. O segundo grupo (grupo controle) foi composto por 26 indivíduos saudáveis ​​(23 a 30 anos). Depois de serem informados das diretrizes e detalhes experimentais, 14 voluntários concordaram em participar do experimento subsequente de ingestão de probiótico Bifidobacterium lactis V9, que foi projetado para avaliar o impacto do Bifidobacterium lactisV9 no microbioma intestinal de indivíduos com SOP. Todos os 14 indivíduos foram solicitados a consumir um total de 10,6 log UFC de Bifidobacterium lactis V9 uma vez ao dia por 10 semanas. Durante o experimento, os indivíduos foram solicitados a evitar a ingestão de outros produtos probióticos ou antibióticos. Amostras fecais foram coletadas nas semanas 0, 2, 4 e 10. Além disso, para avaliar a extensão de Bifidobacterium lactisV9, estabelecemos um período de washout de 3 dias após cada ponto de amostragem, e amostras fecais também foram coletadas durante os períodos de washout. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Hainan (Haikou, China) (HNU-EC-2017011), e o consentimento informado foi obtido de todos os 64 voluntários antes de se inscreverem no estudo. A amostragem e todas as etapas subsequentes descritas foram realizadas de acordo com as diretrizes aprovadas.
Amostras fecais foram coletadas de cada indivíduo pela manhã antes de sua primeira refeição. Depois que o peso da amostra fecal foi determinado, um protetor de amostra (CWBIO, China) foi adicionado na proporção de uma parte de amostra fecal para cinco partes do protetor de amostra, após o que as amostras foram armazenadas a -20°C até processamento adicional . Todas as amostras foram usadas para sequenciamento de alto rendimento da região V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA, e 40 amostras (incluindo 20 de pacientes com SOP e 20 de indivíduos saudáveis ​​de controle) foram selecionadas para sequenciamento metagenômico de espingarda profunda.
Extração de DNA e sequenciamento de alto rendimento da região V3-V4 do gene 16S rRNA bacteriano.
A microbiota intestinal de cada paciente foi isolada e um minikit de fezes de DNA QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemanha) foi usado para extração de DNA metagenômico. A qualidade do DNA metagenômico foi avaliada por espectrofotometria. Selecionamos a região bacteriana V3-V4 do gene 16S rRNA para sequenciamento de alto rendimento ( 45 ). Após a amplificação por PCR, os amplicons foram quantificados e todos os produtos de PCR foram posteriormente reunidos em proporções equimolares para atingir uma concentração final de 100 nmol/litro cada. Em seguida, as amostras foram carregadas em uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento Illumina MiSeq para sequenciamento ( 17 ). O QIIME (v1.7) ( 46) foi utilizada para a análise de bioinformática. Unidades taxonômicas operacionais representativas (OTUs) foram selecionadas e anotadas pelo Projeto de Banco de Dados Ribossomal (RDP) para mais estrutura microbiana e análises taxonômicas ( 47 ).
Sequenciamento metagenômico profundo e controle de qualidade.
Selecionamos 40 amostras, incluindo 20 amostras de pacientes com SOP e 20 amostras de indivíduos saudáveis, para sequenciamento metagenômico de espingarda profunda usando um instrumento Illumina HiSeq 2500. As bibliotecas foram preparadas com um comprimento de fragmento de aproximadamente 300 pb. As leituras em pares foram geradas usando 100 bp nas direções direta e reversa. As leituras foram cortadas usando Sickle e foram posteriormente alinhadas ao genoma humano para remover os fragmentos de DNA do hospedeiro. Uma média de 19,17 Gb de leituras pareadas de alta qualidade foram obtidas de cada amostra, totalizando 815,32 Gb de dados de alta qualidade que estavam livres de DNA humano e contaminantes do adaptador (consulte a Tabela S3 no material suplementar).
Construção de catálogo de genes não redundantes e cálculo da abundância de genes.
As leituras de espingarda foram montadas em contigs e andaimes usando IDBA-UD ( 48 ) e, em seguida, os contigs foram usados ​​para prever os genes funcionais pelo uso de MetaGeneMark ( 49 ). Finalmente, um catálogo de genes não redundantes que continha 2.382.195 genes foi construído usando CD-HIT ( 50 ).
As abundâncias dos genes foram determinadas alinhando as leituras ao catálogo de genes usando Bowtie2 ( 51 ). Posteriormente, para qualquer amostra N, calculamos a abundância em duas etapas da seguinte forma: etapa 1 (cálculo do número de cópias de cada gene),beu=xeueueu; passo 2 (cálculo da abundância relativa do gene i ),umaeu=beu∑eubeu(onde a i representa a abundância relativa do gene i , b i representa o número de cópias do gene i da amostra N , Li representa o comprimento do gene i e x i representa o número de leituras mapeadas) .
Análise de espécies metagenômicas (MGS).
Para a análise de espécies metagenômicas (MGS), o princípio de coabundância e o algoritmo de agrupamento de dossel foram usados ​​para gerar CAGs por binning das leituras de espingarda. Qualquer membro do CAG que tivesse mais de 50 contigs foi considerado como representante de um MGS. Após a remontagem, os MGS foram atribuídos a um determinado genoma quando mais de 80% dos subgenes correspondiam ao mesmo genoma usando BLASTn em um limite de 95% de identidade sobre 90% do comprimento do gene. Se mais de 80% dos genes de um MGS tivessem o mesmo nível taxonômico de atribuição, esse MGS seria identificado como representando o mesmo micróbio.
Anotação funcional e análise de vias metabólicas.
As sequências de aminoácidos anotadas foram alinhadas com os bancos de dados da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) usando BLASTp (valor E de ≤e−5 com uma pontuação de bits maior que 60). As sequências anotadas foram atribuídas a um grupo de ortólogos de KEGG (KO) de acordo com a pontuação mais alta ( 52 ). Os escores Z do repórter foram calculados para revelar as diferenças nas vias metabólicas enriquecidas entre os grupos controle e SOP, conforme descrito anteriormente ( 53 ). Assim, uma pontuação de repórter > 2,3 (90% de confiança de acordo com a distribuição normal) foi usada como um limiar de detecção para diferenciar significativamente entre as vias ( 3 ).
Quantificação de Bifidobacterium lactis V9.
O primer específico da cepa Bifidobacterium lactis V9 foi desenhado de acordo com um fragmento específico (317 pb) na sequência completa das cepas. As sequências dos primers foram as seguintes: V9F, 5'-ACCCATCTCATCCAAACCAAG-3'; V9R, 5'-CACCCAAATGTAAGGAAAAGTCG-3'. A especificidade do primer específico da cepa Bifidobacterium lactis V9 foi confirmada por PCR usando DNA de outras cepas de Bifidobacterium e micróbios intestinais comuns. Cada mistura de PCR (20 μl) continha 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl 2 , uma concentração de 200 μM de cada desoxinucleosídeo trifosfato (dNTP), 1,5 U TaqDNA polimerase (TaKaRa, Japão), concentrações de 0,4 μM dos primers e 10 ng de DNA modelo. O programa de amplificação consistiu em 1 ciclo de 94°C por 2 min; 28 ciclos de 94°C por 45 s, 60°C por 30 s e 72°C por 45 s; e, finalmente, 1 ciclo de 72°C por 7 min. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese a 50 V em gel de agarose a 1,0%. A banda específica foi então extraída, purificada e sequenciada para confirmar ainda mais a especificidade.
Para quantificar o número de células Bifidobacterium lactis V9 no presente estudo, a q-PCR foi realizada em um sistema de detecção ABI Step-One (Applied Biosystems). Para garantir que as células de Bifidobacterium lactis V9 quantificadas estavam vivas, tratamos as amostras com monoazida de propídio e acetato de miristato de forbol (PMA) (30 μM; tempo de exposição de 8 minutos), de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de reação (20 μl) continha 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl 2 , uma concentração de 200 μM de cada dNTP, 0,4 μl de SYBR green I (Invitrogen), 0,4 U TaqDNA polimerase (versão Hot Start) (TaKaRa), concentrações de 0,2 μM dos primers específicos e 2 μl de DNA modelo. O programa de amplificação consistiu em 1 ciclo de 94°C por 20 s; 40 ciclos de 94°C por 5 s, 60°C por 30 s e 72°C por 45 s; e, finalmente, 1 ciclo de 72°C por 180 s. As intensidades de fluorescência foram detectadas durante a última etapa de cada ciclo. Para distinguir o produto de PCR direcionado de produtos de PCR não direcionados, curvas de fusão foram obtidas após amplificação por aquecimento lento de 58 a 95°C em incrementos de 0,2°C com coleta de fluorescência contínua. No momento em que os sinais digitais foram capturados, eles foram transformados em valores representando as quantidades de Bifidobacterium lactisV9 em cada amostra de acordo com a curva padrão quantificada e, por fim, convertidos em valores representativos da quantidade de Bifidobacterium lactis V9 em cada grama de amostra.
Medições de parâmetros metabólicos, hormônios sexuais, mediadores intestino-cérebro e SCFAs intestinais.
Amostras de sangue foram coletadas no Hospital Popular da Província de Hainan para a medição de índices clínicos, incluindo parâmetros metabólicos (TGs, TC e FPG), hormônios sexuais (LH, FSH, LH/FSH, E2, PRL e T) e mediadores cerebrais (PYY e grelina). Os hormônios sexuais foram medidos no dia 3 do ciclo menstrual. Os índices bioquímicos do sangue foram medidos em um analisador bioquímico automático (BS-220; Mindray, China), e os hormônios sexuais foram testados usando um sistema de imunoensaio automatizado (AIA-1200; Tosoh, Japão). Os níveis de grelina e PYY foram determinados usando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) comercialmente disponíveis de acordo com as instruções do fabricante ( 12). Para determinar os níveis de SCFA, usamos aproximadamente 250 mg de amostras fecais congeladas. As concentrações de SCFAs foram determinadas usando uma diluição de 1:25 de 500 μl de sobrenadante. As determinações de espectrometria de massa por cromatografia gasosa (GC-MS) foram realizadas usando um instrumento Varian Saturn 2000 GC-MS com um amostrador automático de microextração em fase sólida (SPME) 8200 CX ( 54 ).
Análise estatística.
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software R. O pipeline usado no presente estudo foi carregado no GitHub e o link é https://github.com/zhjch321123/PCOS_Probiotics.git . A análise de PCoA foi realizada em R usando o pacote ade4 ( 55 ). As abundâncias diferenciais de gêneros, genes e KOs foram testadas com o teste de soma de postos de Wilcoxon e foram consideradas significativamente diferentes com valores de P <<0,01. Para a construção do diagrama de bolhas do caminho, foi utilizado o pacote ggplot2. Para a construção do boxplot foi utilizado o pacote ggpubr. O mapa de calor foi construído usando o pacote “pheatmap” e o diagrama de Sankey foi construído usando o pacote “riverplot”. As redes foram calculadas usando o coeficiente de correlação de postos de Spearman e visualizadas no Cytoscape (versão 3.4).
Disponibilidade de dados.
Os dados de sequência relatados neste artigo foram depositados no banco de dados do NCBI (número de acesso PRJNA513209 [dados de sequenciamento metagenômico]).
AGRADECIMENTOS
Agradecemos sinceramente a todos os voluntários pela participação.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 31701577), a Young Scholar Scientific Research Foundation da SCITOP BIO-TECH (nº 2017-02) e a Fundação de Pesquisa Científica da Universidade de Hainan (nº KYQD1548) .
HZ e JZ desenharam o estudo. KC e TF coletaram amostras. SJ, XB, HC e CM processaram e sequenciaram as amostras. JZ, QP e ZS analisaram os dados. JZ e HZ escreveram o artigo com contribuições e aprovação final de todos nós.